Контроль митоза

Механизм основан на замене классических элементов репликации двойниками, способными работать в аварийных условиях. А именно:

— аварийный комплекс Rad1-Rad9-Hus1 вместо классического PCNA-PCNA-PCNA;

— аварийный комплекс Rad17-(RFC2-RFC3-RFC4-RFC5) вместо

классического RFC1-(RFC2-RFC3-RFC4-RFC5). В аварийном комплексе RFC1 заменен на Rad17, остальные элементы (RFC2-RFC5) остались без изменения.

В представленном списке фигурируют консервативные белки Rad1, Rad9, Hus1 и Rad17. Это сенсоры, чувствительные к повреждениям ДНК.

1. В исходном состоянии с репликационной вилкой связывается комплекс RFC1-5.

2. RFC1-5 устанавливает кольцо из 3 молекул PCNA на ДНК.

PCNA при этом может двигаться по ДНК подобно карабину, скользящему по веревке.

3. С PCNA связывается ДНК-полимераза δ (дельта).

4. Некоторые субъединицы RFC (какие?) в состоянии сигнализировать о повреждениях ДНК, т.е. участвуют в чекпойнте репликации ДНК.

Т.е. RFC1-5 не покидает место событий?

Единственный разрыв ДНК остановит митоз, или кто-то считает количество разрывов?

5. У человека при возникновении повреждений ДНК комплекс Rad17-RFC2-5 погружает на ДНК комплекс белков Rad1-Rad9-Hus1, аналогично тому, как RFC1-5 погружал PCNA на ДНК. При этом Rad9 фосфорилируется.

Rad17 находит разрыв ДНК и устанавливает здесь кольцевой комплекс Rad1-Rad9-Hus1. Это происходит хоть где на ДНК или только вблизи репликационной вилки? Старый PCNA-комплекс при этом удаляется?

Комплексы Rad17 присутствуют всегда или собираются при наличии повреждений?

6. Rad9 человека обладает 3′-5′ экзонуклеазной активностью, известной у ДНК-полимераз, способных к исправлению ошибок репликации.

Rad9 сам исправляет ошибки, ему не нужна ДНК-полимераза?

Сенсоры (Rad1, Rad9, Hus1 и Rad17) активируют следующий класс устройств – датчики. Датчиками в этом методе называются растворимые белки разносящие информацию о повреждении ДНК.

Основные известные датчики — ATM и ATR. ATM и ATR являются протеинкиназами (фосфорилируют).

ATM – реагирует на повреждения ДНК.

ATR – не реагирует на повреждения ДНК. Он фосфорилирует свои эффекторы p53 и Chk1 только при действии ионизирующего излучения (в случае p53) или ультрафиолета (Chk1).

В настоящее время известно не менее четырех эффекторов и соответствующее количество механизмов остановки клеточного цикла:

— путь через Chk1 (Rad1-ATM-Chk1-cdc25C);

— Chk2;

— p53;

— BRCA1;

— остановка цикла неизвестными эффекторами.

Рассмотрим их все.

В качестве мишеней, в основном, выступают G1 и G2-триггеры клеточного цикла.

При ДНК-повреждающих воздействиях Chk1 фосфорилируется датчиками ATR и, возможно, ATM. Предполагается, что в фосфорилированной форме Chk1 легче связывается со своими мишенями.

Три основных механизма (рисунок):

1) Активация Wee1

1. При успешном движении по клеточному циклу комплекс Циклин В – Cdk1 (MPF) фосфорилирует и тем самым отправляет всю Wee1 на деградацию по убиквитиновому пути. G2-триггер — в положении «1».

2. При возникновении повреждений ДНК протеолиз Wee1 блокируется. Chk1-киназа фосфорилирует Wee1. Возможно, это приводит к индукции одного из белков 14-3-3, а Wee1 стабилизируется при связывании c 14-3-3.

3. Далее следует лавинообразный процесс: концентрация Wee1 повышается; киназа Wee1 фосфорилирует Cdk1 по Tyr-15, в результате чего Cdk1 инактивируется; концентрация активной Cdk1 уменьшается и она еще меньше сдерживает Wee1 (на рисунке: тупые стрелки ослабляют мишень, острые — усиливают). Концентрация Wee1 повышается до тех пор, пока G2-триггер не переключится в положение «0».

4. Положение «0» означает, что концентрация MPF поддерживается триггером на близком к нулю уровне и вход в митоз невозможен, остановка в G2.

2) Инактивация Cdc25C

1. При ДНК-повреждающих воздействиях киназа Chk1 фосфорилирует Cdc25C по Ser-216.

2. С фосфорилированной Cdc25C способны взаимодействовать белки 14-3-3epsylon и 14-3-3dzeta. Они связывают Cdc25C и выводят ее из ядра в цитоплазму.

3. Если фосфорилирование по Ser-216 носит массовый или продолжительный характер — правое плечо G2-триггера перестает работать, триггер переключается в положение «0», следует остановка в G2.

3) Ингибирование комплекса циклин E-Сdk2

1. В обычном состоянии фосфатаза Cdc25A активирует Cdk2, дефосфорилируя его по Tyr-15.

2. При ДНК-повреждающих воздействиях Chk1 фосфорилирует Cdc25A, в результате чего последняя быстро распадается.

3. Отсутствие Cdc25A приводит к отсутствию активных Cdk2. Комплексов Циклин Е — Cdk2 также нет.

4. Другими словами, если активность Chk1 приобрела массовый характер, то: концентрация Циклин Е — Cdk2 снижается до точки срабатывания тригера, G1-триггер переключается в положение «0», запоминает и поддерживает это положение с помощью р27 и Е2F. Следует остановка в G1.

Взаимодействие Сhk1 с другими эффекторами

Имеются данные, что Сhk1 фосфорилирует p53. В свою очередь, p53 при участии p21 и pRb способен действовать как ингибитор Chk1. Возможно, эффекторы Chk1 и p53 действуют взаимоисключающе.

При возникновении повреждений ДНК датчики ATM и ATR фосфорилируют киназу Chk2, в результате чего происходит ее активация. Для Chk2 описан один механизм работы:

1) Инактивация Cdc25C

1. При возникновении повреждений ДНК киназа Chk2 (как и рассмотренная ранее Chk1) фосфорилирует Cdc25C по Ser-216.

2. С фосфорилированной Cdc25C способны взаимодействовать белки 14-3-3epsylon и 14-3-3dzeta. Они связывают Cdc25C и выводят ее из ядра в цитоплазму.

3. Если фосфорилирование по Ser-216 носит массовый или продолжительный характер — правое плечо G2-триггера перестает работать, триггер переключается в положение «0», следует остановка в G2.

Взаимодействие Сhk2 с другими эффекторами

Активированная Chk2 положительно влияет на эффектор р53. В обычных («нестрессовых») условиях практически весь p53 инактивируется белком Mdm2. Chk2 фосфорилирует p53 по Ser-15, защищая его от атаки Mdm2.

Кроме этого, активированная Chk2 фосфорилирует BRCA1. При этом BRCA1 также активируется.

p53 координирует все основные процессы поддержания стабильности генома. Он является фактором транскрипции, непосредственно связывается с ДНК в области промоторов многих генов. В этом качестве он регулирует экспрессию более десяти белков, ответственных за активацию различных супрессорных систем.

При возникновении повреждений ДНК p53 трансактивирует не только белки-регуляторы клеточного цикла: активируются также комплексы репарационных белков, а если повреждения оказываются достаточно сильными, запускаются механизмы p53-зависимого апоптоза.

Активация р53:

1. В обычных («нестрессовых») условиях практически весь p53 инактивируется белком Mdm2. Этот белок является p53-специфической убиквитин-лигазой и, кроме того, при связывании с p53 он экранирует его N-концевой трансактивационный домен. В результате, несмотря на то, что ген p53 постоянно транскрибируется и транслируется, сам белок быстро подвергается убиквитин-зависимой деградации, и при этом даже не успевший распасться p53 не проявляет активности.

2. При возникновении повреждений ДНК белки семейства PI3K (ATM, DNA-PK и в меньшей степени ATR) фосфорилируют p53 по Ser-15.

Такая же активность показана и для киназ Chk1 и Chk2, которые, кроме этого, фосфорилируют р53 по ряду других аминокислотных остатков — Ser20, Ser33 и Ser37. В результате конформация N-концевого участка р53 меняется таким образом, что он теряет способность связываться с Mdm2. Таким образом, p53 стабилизируется в ядре и приобретает способность связывать базовые транскрипционные факторы.

3. Однако после описанных изменений в N-концевой области транскрипционная активность p53 все еще остается невысокой. Для усиления транскрипционной активности необходима модификация C-концевого (ДНК-связывающего) участка p53. Эти изменения «запускаются» дефосфорилированием Ser-376, которое также происходит при возникновении повреждений ДНК.

4. После того, как Ser-376 становится дефосфорилированным, с C-концевой областью p53 связываются белки семейства 14-3-3. В результате p53 приобретает конформацию, в которой его C-концевые лизины могут быть ацетилированы различными комплексами (p300/CBP, PCAF). Ацетилирование лизинов в значительной мере увеличивает сродство p53 к ДНК, его транскрипционная активность повышается, и происходит индукция экспрессии различных мишеней.

Мишени р53:

1) р53 обеспечивает экспрессию р21

При возникновении повреждений ДНК p53 стабилизируется и активирует свою основную транскрипционную мишень — белок p21.

p21 способен вызывать остановку клеточного цикла на стадиях как G1 так и G2. p21 влияет на многие компоненты клеточного цикла:

***

Прежде чем рассматривать метод остановки в G2, напомним все известные способы регулирования активности Cdk:

— циклинами (их появлением и разрушением убиквитин-зависимым протеолизом) «грубая регуляция»;

— фосфорилированием Cdk по Thr161 (Tyr-161?) — (T-сайт) при помощи CAK (Cdk активирующей киназы);

— фосфорилированием/дефосфорилированием Cdk по Tyr15 (Y-сайт) — фосфорилирование киназой Wee1, дефосфорилирование фосфатазой cdc25 – «тонкая регуляция»;

— Cdk-ингибирующими белками CKI – связываются с комплексом циклин-Cdk, нарушая активный сайт – «быстрое выключение комплекса циклин-Cdk».

Сdc25C/Wee1-независимая инактивация Cdk1.

p21 блокирует фосфорилирование Cdk1 по Tyr-161, остановка в G2.

Инактивация комплекса циклин А-Cdk2 (на рисунке не показано).

Это еще один метод остановки в G2. p21 способен ингибировать активность комплекса — циклин A-Cdk2. Активность комплекса циклин A-Cdk2 важна для перехода в митоз, ингибирование комплекса может играть роль в остановке клеточного цикла в G2 в ответ на повреждения ДНК.

Ингибирование комплекса циклин E-Сdk2.

p21 является сильнейшим ингибитором комплексов циклин-Cdk2. Этот механизм считается основным путем остановки клеточного цикла в G1 при повреждении ДНК.

Инактивация ДНК-полимеразы δ (дельта, на рисунке не показано).

1. ДНК-полимераза δ закреплена на кольцевом комплексе из трех молекул PCNA. p21 может взаимодействовать с C-концевым доменом PCNA. Считается, что в комплексе с p21 PCNA не способен увеличивать процессивность ДНК-полимеразы δ (репликация ядерной ДНК), при этом репарирующая активность полимеразы не уменьшается.

2. Белок GADD45, вероятно, также способен связываться с PCNA, увеличивая скорость репарации и уменьшая процессивность ДНК-полимеразы δ.

Гиперэкспрессия BRCA1 останавливает клетки как в G1, так и в G2-фазе клеточного цикла.

BRCA1 не связывается непосредственно с ДНК. Основные его мишени — транскрипционные факторы отдельных генов.

1. BRCA1 входит в состав РНК-полимеразы II. Это чтение генов, не репликация. Видимо, контролирует повреждения постоянно, а не только во время деления. Активен только в составе РНК-полимеразы?

2. При возникновении повреждений BRCA1 активируется под действием киназ ATM, ATR и эффектора Сhk2.

3. Активированный BRCA1 активирует белок ZBRK1. ZBRK1 — это транскрипционный фактор.

4. ZBRK1 каким-то образом организует транскрипцию GADD45.

ZBRK1 взаимодействует с регуляторной областью гена GADD45. Однако вопреки ожиданиям, ZBRK1 оказался не активатором, а, наоборот, репрессором GADD45. Причем его репрессорная функция проявляется только в присутствии BRCA1.

Сообщается о проводимом скрининге ДНК-библиотек. В результате установлено, что, помимо GADD45, еще как минимум десять генов содержат 15-нуклеотидную последовательность, узнаваемую ZBRK1. Каким образом происходит ZBRK1-зависимая регуляция транскрипции этих генов (и происходит ли она вообще)?